槐米是高效豆科植物槐的干燥花蕾，有凉血止血，液相清肝泻火等功效。色谱芦丁为槐米的法测主要活性成分，目前我国医药工业中常以槐米为主要原料提取芦丁，定槐的不度评定含量最高可达30%左右。米中芦丁属于黄酮类化合物，芦丁研究表明，确定芦丁具有抗心脑血管疾病、高效免疫调节作用、液相抗氧化、色谱延缓衰老等作用。法测芦丁可以直接作为药品，定槐的不度评定也用于复配和药物的米中中间体，可用作抗氧剂及天然食用黄色素。芦丁国外主要用于食品、化妆品的添加剂和着色剂。

本实验建立了槐米中芦丁含量测定的高效液相色谱方法，参考JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》和CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》建立数学模型，定量测定不确定度的各个分量，考察影响不确定度的主要因素，初步建立了适用于评估HPLC法测定槐米中芦丁含量不确定度的方法，以期加强对含量测定结果准确性和可信度的认识，为样品前处理步骤繁琐的分析方法建立有效的不确定度评定程序提供参考。

一、材料与方法

1、材料与试剂

芦丁标准品（含量HPLC：90.5%）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯；槐米药材收集于山西、陕西和广西等地，经山西省林业科学研究院张素华高级工程师鉴定为豆科植物槐SophorajaponicaL的花蕾。

2、仪器与设备

LC-2010AHT高效液相色谱仪；AB104.N分析天平；KQ3200DE数控超声清洗器；UPHW-I-90T型优普系列超纯水系统。

3、实验方法

（1）对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品5.4mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得0.0979g／L的储备液，4℃冰箱中保存备用。

（2）供试品溶液的制备

称取槐米粗粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇，称定重量，超声处理（功率250W，频率25kHz）30分钟，放冷后再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过作为供试品溶液。同时以甲醇做空白对照溶液。

（3）色谱条件

色谱柱：Agela.InnovalC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色谱柱；检测器：紫外检测器；柱温：30℃；流速：1.0mL／min。流动相∶甲醇-1%冰醋酸溶液（32∶68），等度洗脱；检测波长：257nm，进样量：10μL。

4、数学模型

槐米中芦丁的计算公式为：

式中：X为样品中芦丁含量，%；C为供试液中芦丁浓度，g／L；V为供试液体积，mL；m为样品质量，g；F为稀释因子。

5、不确定度来源分析

本方法操作步骤相对复杂，影响因素较多，通过分析整个实验过程的影响因素，并参照含量计算公式，分析不确定来源主要包括：样品制备均匀度、样品的定容、标准品、标准曲线的拟合和仪器重复性等方面。

二、来源与分析

1、样品制备均匀度引入的不确定度

被测样品花蕾不同部位的芦丁含量差异较大，按照标准取样方法，将同一批次样品全部粉碎混匀后，称取10份按槐米粗粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇，称定重量，超声处理（功率250W，频率25kHz）30分钟，放冷后再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过作为供试品溶液。同时以甲醇做空白对照溶液分别测定，评定样品制备的均匀度，测定结果见表1。另外重复性测量已包括在样品均匀度的试验中。

芦丁含量的平均值：X-=18.54%

测定标准差Sx用贝塞尔公式计算：

样品分布均匀度引入的相对标准不确定度u（x）为：

2、样品定容引入的不确定度

（1）由校准引入的标准不确定度

根据JJG196—2006《常用玻璃量具检定规程》，A级50mL单标线吸量管最大允差为±0.050mL，A级2mL分度吸量管最大允差为±0.012mL，A级10mL单标线容量瓶最大允差为±0.020mL，属B类评定，按照矩形分布考虑，k=根号3，合成校准引入的相对不确定度：

（2）由温度变化引入的标准不确定度

在样品处理过程中需量取甲醇50mL、续滤液2mL并定容至10mL，实验室的温度在±4℃之间变动，20℃甲醇体积膨胀系数为1.19×10-³／℃。在实验操作时，移液管和容量瓶中的溶液所处环境的温度差异很小，因此可以忽略不计。假设温度变化是矩形分布，由温度变化产生的不确定度根据公式（2）计算，结果为：u（t₁)=0.137,u(t₂)=0.00550,u(t₃)=0.0275

合成温度引入的相对标准不确定度：

由上述分量合成样品定容引入的相对标准不确定度为：

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